Mechanizmy i biomarkery w zespole Behçeta – wyniki badania BIO-BEHÇET’S

Jakie mechanizmy prowadzą do rozwoju zespołu Behçeta?

Zespół Behçeta jest klasyfikowany jako układowe zapalenie naczyń o zmiennym obrazie, jednak zrozumienie podstawowych mechanizmów patofizjologicznych pozostaje ograniczone. Wiadomo, że kluczową rolę odgrywa szlak czynnika martwicy nowotworów (TNF), a zarówno inhibitory TNF, jak i leki biologiczne z grupy interferonu-α wykazują dobre wyniki u pacjentów niereagujących na kortykosteroidy i immunomodulatory pierwszej linii.

Zespół Behçeta jest uważany za wielogenowe zaburzenie autoimmunologiczne, napędzane przez interakcję epistatyczną między wariantami genów HLA-B51 i ERAP1, które wpływają na przetwarzanie i prezentację peptydów. Inne genetyczne czynniki ryzyka różnią się w zależności od populacji.

Podobnie jak w przypadku innych złożonych chorób przewlekłych, istnieje potrzeba lepszego zrozumienia fenotypu pacjentów z zespołem Behçeta w badaniach klinicznych oraz zbadania potencjalnych biomarkerów, które mogą pomóc w ukierunkowaniu terapii i zminimalizowaniu działań niepożądanych – ponieważ obecnie takie biomarkery nie są dostępne. Badanie BIO-BEHÇET’S, którego wyniki kliniczne opublikowano wcześniej, było pragmatycznym, randomizowanym badaniem z dwiema równoległymi grupami porównującym skuteczność leków biologicznych po niepowodzeniu terapii pierwszej linii. W ramach tego badania przeprowadzono eksploracyjną analizę dwóch potencjalnych biomarkerów: genetycznych i metabolomicznych.

Trzy badania asocjacyjne całego genomu u pacjentów z zakażeniem wirusem zapalenia wątroby typu C genotypu 1 wskazały na polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) w obrębie locus genu IFNL3 (IL28B), kodującego interferon lambda na chromosomie 19q13.13, związane z odpowiedzią na terapię interferonem alfa. Szczególnie pacjenci z genotypem rs12979860 CC wykazywali wyższe wskaźniki odpowiedzi na interferon-α. Chociaż SNP w rs12979860 wpływa na produkcję genów stymulowanych interferonem jako część wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, dokładny mechanizm pozostaje niejasny. Niedawne badanie sekwencjonowania równoległego sugerowało, że rs4803221 i rs7248668 lepiej przewidywały brak odpowiedzi niż rs12979860. Inne niedawne badanie wykazało, że rs12979860 jest w nierównowadze sprzężeń z wariantem zmiany ramki odczytu, ss469415590 [ΔG], który tworzy również nowy gen zwany IFNL4 – zmniejszona ekspresja tego genu może być związana ze zmniejszoną odpowiedzią komórek na interferon alfa.

Jak zaprojektowano badanie BIO-BEHÇET’S i jakie metody zastosowano?

Algorytmy leczenia uwzględniające genotypowanie IFNL3 są obecnie stosowane w wielu klinikach do leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C. Nie jest jasne, czy te same SNP wpływają na odpowiedź na interferon alfa w innych chorobach, ale biorąc pod uwagę rolę wrodzonego układu odpornościowego w patogenezie zespołu Behçeta, jest biologicznie prawdopodobne, że podobny efekt do obserwowanego w wirusowym zapaleniu wątroby typu C z interferonem alfa może występować w zespole Behçeta. Eksploracyjna analiza w BIO-BEHÇET’S testowała tę hipotezę.

Badanie BIO-BEHÇET’S miało na celu stworzenie bazy dowodowej dla skutecznego przepisywania leków biologicznych w zespole Behçeta oraz identyfikację sposobów przewidywania i pomiaru odpowiedzi na leczenie. Badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednie komisje etyczne i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pacjenci z aktywnym zespołem Behçeta, u których wystąpiła niewystarczająca odpowiedź lub nietolerancja na kortykosteroidy miejscowe lub drobnocząsteczkowe immunomodulatory pierwszej linii, zostali losowo przydzieleni do grupy otrzymującej infliksymab (REMICADE) lub interferon-α2a (ROFERON) zgodnie z odpowiednim protokołem leczenia zespołu Behçeta w Anglii. Odpowiedź na leczenie określono jako zmianę wskaźnika aktywności choroby Behçeta (BDAI) oraz znaczącą poprawę w zajętych układach narządów podczas wizyt w 12. i 24. tygodniu.

W oparciu o wcześniejsze prace dotyczące wirusowego zapalenia wątroby typu C – i biorąc pod uwagę rolę wrodzonego układu odpornościowego w patogenezie – w badaniu BIO-BEHÇET’S zbadano SNP IFNL3 i IFNL4 jako biomarkery odpowiedzi na interferon-α2a i/lub infliksymab, a także potencjał metabolomiki moczu jako biomarkerów odpowiedzi na leki.

Analiza metabolomiczna obejmowała zbieranie próbek moczu (1 ml) na początku badania oraz w tygodniach 12, 24 i 36. Próbki były natychmiast zamrażane i przechowywane w temperaturze -80°C przed transportem do laboratorium. Po rozmrożeniu próbki moczu wirowano, przygotowywano przy użyciu standardowego protokołu i ładowano do standardowej probówki do spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Spektra 1H NMR pozyskiwano na systemie Bruker 600 MHz IvDR NMR. Wszystkie próbki były odpowiednio przygotowane przed akwizycją danych. Dane wstępnie przetwarzano, w tym wykluczano określone regiony, wyrównywano segmenty, filtrowano szumy, normalizowano spektra i eksportowano do arkusza Excel do analizy statystycznej.

Jednowymiarowe widma 1H uzyskano w temperaturze 300°K przy użyciu standardowej sekwencji impulsów spin-echo z tłumieniem wody na spektrometrze NMR Bruker DRX 500 MHz wyposażonym w kriosondę. Poziomy glutaminy mierzono w próbkach moczu za pomocą wysokowydajnej chromatografii wymiany jonowej, a poziomy kwasu ksanturenowego mierzono metodą fluorometryczną. Listy metabolitów zapewniających największą dyskryminację między grupami zidentyfikowano za pomocą analiz wielowymiarowych, a metabolity zidentyfikowano przy użyciu bazy danych NMR i pakietu Chenomx NMR. Przestrzegano ścisłych środków kontroli jakości, zapewniając właściwą walidację wyników genotypu.

Jakie wyniki przyniosła analiza mechanistyczna i genetyczna?

Badania mechanistyczne zaprojektowano, aby: (a) prowadzić do ważnych odkryć w wyjaśnieniu dotychczas nieznanych procesów patofizjologicznych leżących u podstaw zespołu Behçeta, (b) wyjaśnić rolę dwóch szlaków zapalnych zaangażowanych w różne objawy choroby i odpowiedzi (lub nie) na dwa różne leki biologiczne, które celują w różne procesy zapalne oraz (c) zidentyfikować potencjalną użyteczność dwóch obiecujących nowych biomarkerów ułatwiających opłacalne ukierunkowanie terapii.

Genotypy uzyskano dla 62 osób (30 w grupie infliksymabu i 32 w grupie interferonu-α2a) dla wszystkich SNP, z wyjątkiem rs7248668, gdzie genotypu jednej osoby (interferon-α2a) nie udało się uzyskać pomimo powtórzonych prób. Wszystkie SNP przeszły ustalone wcześniej progi kontroli jakości. Dane sugerują wysoką nierównowagę sprzężeń między rs12979860 i rs368234815 oraz między rs4803221 i rs7248668.

Analizę asocjacji genotypu z binarnym wynikiem odpowiedzi na podstawie 20%, 50% lub 70% odpowiedzi przeprowadzono za pomocą testu chi-kwadrat Pearsona dla wszystkich SNP u wszystkich osób, a także stratyfikując dla infliksymabu lub interferonu-α2a. Te analizy sugerują, że jedyne statystycznie istotne asocjacje dotyczą SNP rs4803221 i rs7248668 w grupie interferonu-α2a, i tylko przy zastosowaniu 70% odpowiedzi binarnego fenotypu (p = 0,021 i 0,025); jednak po korekcie dla wielokrotnych testów (współczynnik fałszywych odkryć [FDR]), te asocjacje nie są już istotne (skorygowana wartość p > 0,05).

Kolejna analiza określiła genetyczne powiązanie z czterema ciągłymi zmiennymi wynikowymi: BDAI na początku badania, po 3 i 6 miesiącach oraz pole pod krzywą BDAI skorygowane względem wartości początkowej (AUC). Wykorzystano do tego ANOVA z korektą Bonferroniego. Zaobserwowano nominalnie istotne statystycznie powiązanie dla AUC BDAI skorygowanego względem wartości początkowej zarówno dla rs12979860, jak i rs368234815 tylko u pacjentów leczonych infliksymabem (p = 0,055); jednak po korekcie dla wielokrotnych testów (FDR) nie było to już istotne (Pc > 0,05).

Analiza metabolomiczna nie wykazała istotnych różnic w metabolitach na początku badania między pacjentami przydzielonymi do infliksymabu lub interferonu-α2a, co potwierdza brak istotnych czynników zakłócających, które mogłyby wpłynąć na odpowiedź na określone leczenie. Dane NMR analizowano jako przedziały (bins) zawierające wiele metabolitów. Trzy przedziały wykazały istotne różnice między dwiema grupami leczenia; jednak żaden nie pozostał istotny po korekcie dla wielokrotnych porównań wszystkich przedziałów.

Aby sprawdzić, czy leczenie zmieniło profile metabolitów, próbki pobrane na początku badania od pacjentów przyjmujących infliksymab lub interferon-α2a porównano z próbkami od tego samego pacjenta pobranymi w 24. tygodniu. Wyniki analizy głównych składowych (PCA) nie wykazały istotnych różnic w profilach metabolitów między dwiema próbkami. Określone przedziały wykazały istotność, chociaż została ona utracona po korekcie dla wielokrotnych porównań.

Aby określić, czy profile metabolitów były związane z odpowiedzią na poszczególne leki, porównano próbki moczu w 24. tygodniu od pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na leczenie. Próbki od pacjentów przyjmujących infliksymab wykazały podobne grupowanie w analizie PCA. Określone przedziały ponownie wykazały istotne różnice, przy czym jeden przedział (B1281P8.546) pozostał istotny po korekcie dla wielokrotnych porównań.

W przypadku pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na interferon-α2a wystąpiła słaba separacja między grupami w analizie PCA, szczególnie grupowanie próbek od pacjentów odpowiadających. Ten wzorzec mógł być spowodowany określonymi przedziałami, które były istotnie różne między grupami, chociaż ta istotność została utracona po korekcie dla wielokrotnych porównań.

Co sugerują wyniki dotyczące terapii i predykcji odpowiedzi?

Badanie BIO-BEHÇET’S zawierało komponent mechanistyczny, aby ocenić potencjał przewidywania odpowiedzi na leczenie infliksymabem lub interferonem-α2a, które posiadają odrębne mechanizmy działania. Genetyka i metabolomika moczu zostały wykorzystane do dalszej poprawy efektywności kosztowej i precyzji. Genotypowanie czterech SNP w locus genu IFNL3 (IL28B) przeprowadzono w oparciu o literaturę potwierdzającą ich rolę w przewidywaniu eliminacji wirusa w zakażeniu wirusowym zapaleniem wątroby typu C, a metabolomika moczu oparta na NMR wykazała obiecujące wyniki w przewidywaniu odpowiedzi w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

Dane genetyczne sugerują związek między wynikiem pacjenta a nosicielstwem wariantów rs4803221 lub rs7248668 w locus genu IFNL3 (IL-28B) – ale tylko dla grupy interferonu-α2a. Ta obserwacja jest zgodna z wcześniejszymi ustaleniami, które wykazują istotny związek między tymi dwoma SNP a wynikami leczenia interferonem-α2a w wirusowym zapaleniu wątroby typu C. Może to wskazywać na potencjał przewidywania wyników pacjenta w odpowiedzi na interferon-α2a zgodnie z genotypem w tej populacji pacjentów. Jednak biorąc pod uwagę stosunkowo małą wielkość próby i fakt, że istotność statystyczna związku jest negowana przez korektę dla wielokrotnych testów, wyniki należy traktować z ostrożnością. Większe, odpowiednio zasilane badania genetyczne są potrzebne do weryfikacji tego odkrycia w kontekście zespołu Behçeta.

BIO-BEHÇET’S jest pierwszym prospektywnym badaniem head-to-head wykorzystującym metabolomikę do zbadania potencjalnych różnic w działaniu dwóch leków biologicznych w leczeniu zespołu Behçeta. Analiza metabolomiczna nie wykazała istotnych różnic między pacjentami na początku badania przed randomizacją, co potwierdza brak istotnych czynników zakłócających, które mogłyby wpłynąć na odpowiedź na określone leczenie. Analiza między indywidualnymi profilami metabolitów moczu pacjentów na początku badania w porównaniu do 24 tygodni nie wykazała istotnych różnic, co sugeruje, że leki nie indukowały rozległych zmian systemowych w procesach metabolicznych, a raczej wszelkie efekty byłyby spowodowane specyficznymi zmianami metabolicznymi w ścieżce docelowej każdego leku.

Zostało to potwierdzone przez porównanie próbek moczu z 24. tygodnia od pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na ten sam lek. Dla infliksymabu jeden przedział pozostał istotny po korekcie wielokrotnej, chociaż grupowanie PCA było słabsze dla pacjentów przyjmujących interferon-α2a. Chociaż interesujące, należy zauważyć, że porównanie między pacjentami odpowiadającymi i nieodpowiadającymi podzieliło każdą grupę, prowadząc do mniejszej liczby próbek do analizy.

Dane genetyczne sugerują możliwość związku między odpowiedzią na leczenie a nosicielstwem wariantów rs4803221 lub rs7248668 w locus genu IFNL3 (IL-28B) dla grupy leczonej interferonem, zgodnie z powiązaniem między tymi dwoma SNP a wcześniej obserwowanymi wynikami leczenia interferonem-α2a w wirusowym zapaleniu wątroby typu C.

Ponieważ to badanie było zaprojektowane do oceny pierwszorzędowego punktu końcowego, jakim jest skuteczność kliniczna, te eksploracyjne wyniki biomarkerów należy traktować z ostrożnością ze względu na małą liczebność w podgrupach odpowiadających na leczenie. Ale nie było różnic w analizie metabolomicznej na początku badania między pacjentami przed randomizacją, co wskazuje na brak istotnych czynników zakłócających, które mogłyby wpłynąć na odpowiedź na określone leczenie. Porównanie próbek moczu z 24. tygodnia od pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na ten sam lek za pomocą analizy głównych składowych ujawniło dla infliksymabu jeden określony przedział metabolitów, który pozostał istotnie różny przy porównaniu pacjentów odpowiadających z nieodpowiadającymi. Ten efekt był słabszy dla interferonu-α2a. Dalsza praca będzie charakteryzować odpowiednie metabolity z istniejących próbek, aby informować o przyszłych prospektywnych badaniach, które mogą być zaprojektowane jako prospektywne badania kohortowe lub badania rzeczywiste, aby umożliwić bardziej szczegółowe zbadanie tego tematu i objęcie większej liczby pacjentów klinicznie.

Podsumowanie

Zespół Behçeta jest układowym zapaleniem naczyń o złożonej patofizjologii, w której główną rolę odgrywa szlak TNF oraz interakcja między genami HLA-B51 i ERAP1. Badanie BIO-BEHÇET’S koncentrowało się na ocenie skuteczności leków biologicznych (infliksymab i interferon-α2a) oraz identyfikacji potencjalnych biomarkerów odpowiedzi na leczenie. Analiza genetyczna wykazała możliwy związek między wariantami rs4803221 i rs7248668 w genie IFNL3 a odpowiedzią na interferon-α2a, jednak wyniki te wymagają potwierdzenia w większych badaniach. Badania metabolomiczne nie ujawniły istotnych różnic w profilach metabolitów na początku badania, sugerując brak czynników zakłócających wpływających na odpowiedź terapeutyczną. Zaobserwowano pewne różnice w profilach metabolicznych między pacjentami odpowiadającymi i nieodpowiadającymi na leczenie, szczególnie w przypadku infliksymabu. Wyniki badania wskazują na potencjalne możliwości wykorzystania markerów genetycznych i metabolomicznych w przewidywaniu skuteczności terapii, jednak konieczne są dalsze badania na większych grupach pacjentów.